آشنایی با سانتریفیوژ آزمایشگاهی

سانتریفیوژ چیست

سانتریفیوژ دستگاهی است که در آن چرخش نمونه­‌های مایع در سرعت­‌های بالا و در نتیجه ایجاد یک نیروی گریز از مرکز قوی باعث می‌­شود که مواد متراکم‌­تر و چگال­تر، خیلی سریعتر از نیروی حاصل از جاذبه نرمال به سمت انتهای لوله سانتریفیوژ حرکت کنند.قیمت اتوکلاو آزمایشگاهی سانتریفیوژ ها برای جدا کردن ذرات از محیط مایع به وسیله رسوب دادن آنها به کار می‌­روند.

سانتریفیوژ کردن یک فرآیند است که شامل استفاده از نیروی گریز از مرکز برای رسوب مخلوط ناهمگن با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ آزمایشگاهی می­‌باشد و در کارهای صنعتی و آزمایشگاهی استفاده می­‌شود. این فرآیند برای جدا کردن دو ماده مخلوط ­نشدنی استفاده می­‌شود. سانتریفیوژ کردن بر اساس نیروی گریز از مرکز، دوران حول یک نقطه ثابت و وارد نمودن فشار بر روی فازهای مختلف یک مخلوط انجام می­‌گردد. مخلوط می‌­تواند به صورت گاز، مایع و یا ترکیب هر دو باشد.

اگر این دستگاه مجهز به شاخک­‌های نگه­دارنده لوله باشد، آن را سانتریفیوژ معمولی و اگر مجهز به دیسک یا صفحه دایره­ای شکل مخصوص جاگذاری لوله‌های موئین باشد آن را سانتریفیوژ میکرو یا هماتوکریت می‌گویند.

کاربرد سانتریفیوژ آزمایشگاهی

از سانتریفیوژ آزمایشگاهی برای جداسازی سیالات، گاز یا مایعات بر اساس چگالی به کار می­‌رود. فرآیند جداسازی با چرخش ظروف حاوی نمونه با سرعت بالا رخ می­‌دهد. نیروی سانتریفیوژی، مواد سنگین‌­تر را در انتهای ظرف حاوی نمونه قرار می­‌دهد. بعنوان مثال برای جداسازی ذرات تشکیل دهنده خون (مثل پلاسما، گلبول سفید و گلبول قرمز خون)، از سانتریفیوژ کردن استفاده می‌شود.

اساس کار دستگاه سانتریفیوژ

در یک سانتریفیوژ آزمایشگاهی، مخلوطی ناهمگن از جامد و مایع بوسیله چرخش جدا می­‌شوند. پس از یک فرآیند سانتریفیوژی موفق، رسوبات جامد در ته لوله آزمایش ته‌نشین شده و نمونه سانتریفیوژی شفاف خواهد بود. اساس فیزیکی جداسازی اعمال نیروی گریز از مرکز (centrifugal force) بر روی ذرات در حال دوران است که با شعاع میدان دوران و سرعت دوران نسبت مستقیم دارد. ذرات سنگین‌­تر زودتر رسوب می‌­کنند و بقیه ذرات بر حسب وزن مخصوص خود رسوب می­‌کنند. سانتریفیوژی که دارای شعاع کمتر است، باید نسبت به سانتریفیوژی که شعاع بیشتری دارد، با سرعت بیشتری بچرخد تا همان نیروی سانتریفیوژ نسبی (RCF) را ایجاد کند. هر چه شعاع چرخش یک سانتریفیوژ بیشتر باشد، سرعت ته‌­نشین شدن ذرات بیشتر است.

بعبارت دیگر، یک سانتریفیوژ مجموعه‌­ای از تجهیزات است که یک شی را با استفاده از نیروی بالقوه قوی عمود بر محور چرخش (گریز از مرکز) به دور محور ثابت (حول یک دایره) به چرخش در می‌­آورند. سانتریفیوژ آزمایشگاهی با استفاده از اصل رسوب‌گذاری کار می‌کند که در آن شتاب گریز از مرکز باعث می‌شود تا مواد متراکم‌تر و ذرات به سمت بیرون و در جهت شعاعی حرکت کنند. در همان لحظه، ذراتی که دارای چگالی کمتر هستند، تغییر مکان داده و به سمت مرکز حرکت می‌کنند. در این دستگاه‌های آزمایشگاهی که از لوله‌های نمونه استفاده می‌شود، شتاب شعاعی باعث می‌شود که ذرات چگال‌تر در ته لوله ته‌نشین شوند، در حالیکه مواد با چگالی کم به سمت بالا می‌آیند.

اساس سانتریفیوژ حرکت دورانی حول یک محور ثابت است. افزایش قدرت نیروی سانتریفیوژ بستگی به شعاع دوران و سرعت دوران دارد. این نیرو، نیروی نسبی سانتریفیوژ (Relative Centrifugal Force) یا RCF نامیده می­‌شود که بر اساس ضریبی از g بیان می‌­گردد.

نحوه محاسبه RCF

r = (شعاع از مرکز شافت موتور تا وسط لوله) شعاع سانتریفیوژ بر حسب cm

RPM = دور در دقیقه rate per minute

واحد RCF بر­حسب xg بیان می‌­شود.

راه دیگر برای تعیین RCF استفاده از نموگرام می­‌باشد.

تاریخچه دستگاه سانتریفیوژ

اوایل قرن بیستم پوسترهای تبلیغاتی برای جداسازی مواد لبنی از شیر دیده می‌شد. مهندس نظامی انگلیسی بنیامین رابینر (1707 – 1751) یک دستگاه بازوی چرخان برای تعیین کشش اختراع کرد. در سال 1864، آنتونین پرانتل ایده یک سانتریفیوژ لبنی برای جداسازی خامه از شیر را مطرح کرد. این ایده بعداً توسط برادرش، الکساندر پرانتل، در جهت بهبود طراحی قبلی توسعه داده شد و یک نمونه دستگاه استخراج چربی کره در سال 1875 به نمایش گذاشته شد.

هدف سانتریفیوژ

سانتریفیوژهای با سرعت خیلی بالا و التراسانتریفیوژها توانایی تولید شتاب خیلی زیاد بوده که می‌توانند ذرات ریز تا مقیاس نانو و مولکول‌های با جرم‌های متفاوت را جدا کنند.

سانتریفیوژهای بزرگ برای شبیه‌سازی شتاب گرانش بالا یا شتاب‌های محیطی (بعنوان مثال تمرین High-G برای آموزش خلبانان) استفاده می‌شوند. سانتریفیوژهای با سایز متوسط در ماشین‌های لباسشویی و در بعضی استخرهای شستشو برای گرفتن آب پارچه استفاده می‌شود.

سانتریفیوژ های گازی برای جداسازی ایزوتوپ‌ها استفاده می‌شود؛ مانند غنی سازی سوخت هسته ای برای ایزوتوپ شکاف پذیر.

انواع سانتریفیوژ

سانتریفیوژ با دور بالا

در سانتریفیوژهای آزمایشگاهی با دور بالا، سرعت دور تند بین 21000 – 24000 rpm دور در دقیقه تا حداکثر 30000 rpm می‌­باشد. از این سانتریفیوژها بیشتر جهت تهیه فرآورده­‌های خونی استفاده گشته و همگی یخچال­دار هستند. دو نوع سانتریفیوژ با دور بالا وجود دارد:

1. سانتریفیوژ کم ظرفیت
2. سانتریفیوژ پر ظرفیت

سانتریفیوژهای کم ظرفیت مدل Discrete Sampling می­‌توانند میکرو ارگانیسم ­ها، سلول­‌ها، ویروس‌­ها و اورگانل­‌های سلولی را جدا نمایند. سانتریفیوژهای پرظرفیت مدل Continuos Flow برای جداسازی مخمرها، باکتری‌­ها و ویروس‌­ها از محیط کشت، پروتئین­‌ها و باکتریوفاژها از نمونه‌های رقیق‌شده کاربرد دارند.

سانتریفیوژ با دور پایین

در سانتریفیوژهای آزمایشگاهی با دور پایین، دور دوران بین 2000 – 6000 rpm تا حداکثر 8000 rpm بوده و در هر دو نوع یخچال­دار و بدون یخچال موجود می‌­باشند. بیشتر جهت سانتریفیوژ کردن سلول‌‌های خونی یا ذرات حجیم استفاده شده و برای جداسازی ذرات ریز سرعت آنها کافی نیست.

اولتراسانتریفیوژ

در اولتراسانتریفیوژها معادل 75,000 – 100,000 rpm تا حداکثر 120,000 rpm می‌­باشد. اولتراسانتریفیوژ ها برای تفکیک مواد تشکیل­‌دهنده سلولی کاربرد داشته و همگی دارای یخچال می‌­باشند؛ زیرا در دورهای بالا، اصطکاک هوا باعث گرم‌شدن دستگاه شده و در نتیجه، منجر به تخریب پروتئین‌­ها خواهد شد. اولترا سانتریفیوژ ها بطور معمول در مراکز تحقیقاتی استفاده می­‌شوند.

سانتریفیوژهای شناور (Horizontal / Swing bucket / Swing out head)

در این نوع سانتریفیوژها، جایگاه قرار گرفتن نمونه­‌ها طبق نیروی ثقل عمود بر زمین بوده، اما با شروع حرکت، ابتدا از حالت عمودی خارج شده و زاویه پیدا می‌کند. سپس کاملاً شناور گشته و طبق نیروی گریز از مرکز به سمت خارج و به حالت افقی با سطح زمین در می‌­آیند؛ لذا به آن نوع شناور یا swing گفته می­‌شود. بطور خلاصه در این نوع سانتریفیوژ آزمایشگاهی، در حالت توقف وضعیت عمودی، و در حالت دوران، نمونه‌ها وضعیت افقی با سطح زمین دارند.

در این نوع سانتریفیوژ ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مرکز به بخش خارجی یعنی انتهای لوله­‌ها رانده شده و رسوب بصورت یک لایه تقریباً یکنواخت در ته لوله تشکیل می­‌گردد. در پایان عمل لوله‌­های حاوی نمونه مجدداً به حالت عمودی در آمده، رسوب در ته لوله و محلول شفاف در بالای آن قرار می‌‌گیرد. می‌­توان با پیپت پاستور یا سمپلر، مایع فوقانی را از رسوب جدا کرد. در صورتیکه دور سانتریفیوژ آزمایشگاهی بالا باشد و یا زمان دوران افزایش یابد، می­‌توان حتی رسوب را از محلول فوقانی جدا کرد.

سانتریفیوژ زاویه ثابت (Fixed angle / Angle head)

لوله حاوی نمونه نسبت به محور دوران یک زاویه ثابت دارد. این زاویه از 25 تا 45 درجه می‌­تواند متغیر باشد. در این نوع سانتریفیوژ آزمایشگاهی نیز ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مرکز به سمت خارج از محور دوران رانده می­‌شوند؛ اما بر خلاف سانتریفیوژهای شناور، رسوب در جدار و بخشی از کف لوله که در قسمت خارجی محور دوران قرار دارد، رانده می‌­شود. البته هر قدر این زاویه نسبت به محور دوران کمتر باشد، رسوب بیشتر در جداره تشکیل می­‌گردد و اگر زاویه بیشتر باشد، رسوب بیشتر در کف تشکیل می‌­گردد. از آنجایی که شکل آیرودینامیک چرخاننده اجازه دوران در دور بالاتر و رسوب ذرات ریزتر را می­‌دهد، لذا میزان رسوب‌­دهی این نوع سانتریفیوژها از نوع شناور بالاتر است.

سانتریفیوژ محوری (Axial)

در واقع، لوله حاوی نمونه در طول محور عمودی خود دوران می­‌کند (بر خلاف سانتریفیوژهای معمولی که در طول محور افقی دوران می‌­کنند!) این دستگاه‌­ها به طور تجاری برای مقاصد بالینی در دسترس می­‌باشند. معمولاً خون بیمار در لوله­‌های سپتوم­‌دار وکیوم شده، نمونه‌گیری گشته، سپس در جایگاه مخصوص خود بنام Axial Separation Module قرار داده شده و بطور خودکار در طول محور عمودی خود شروع به دوران می­‌کند. ممکن است یک سوزن از طریق درب پلاستیکی (سپتوم) داخل لوله شده و از قسمت مرکزی، نمونه شفاف‌شده را برداشت کند. در این روش ذرات معلق که می‌­توانند سلول­‌های خونی باشند، به قسمت محیطی لوله‌ها رانده می­‌شوند. در انواع تجاری این دستگاه‌­ها کل فرآیند جداساز در طی 70 ثانیه کامل می‌­گردد که زمان مناسبی می­‌باشد.

سانتریفیوژ سایتولوژی

از این نوع سانتریفیوژ برای قرار دادن سلول­‌های موجود در یک مایع روی اسلاید میکروسکوپ استفاده می­‌شود. در موقع استفاده کاربر ظرف مخصوص نمونه، صفحه فیلتر و یک اسلاید را کنار هم قرار می‌­دهد. سپس همگی را در داخل روتور گذاشته مایع مورد نظر را در ظرف مخصوص نمونه قرار داده و دستگاه را روشن می­‌کند. بعد از فعال‌شدن دستگاه، مایع با فشار در تماس با مجموعه فیلتر / اسلاید قرار می­‌گیرد.

معمولاً سانتریفیوژها با دور 200 – 4000 rpm کار کرده و زمان سانتریفیوژ 99-1 دقیقه متغیر است.

سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

سانتریفیوژ میکروهماتوکریت با استفاده از نیروی گریز از مرکز، هماتوکریت خون (نسبت حجم یاخته‌­های سرخ به کل حجم خون) را مشخص می­‌کند. این نوع سانتریفیوژ آزمایشگاهی دارای روتوری می‌­باشد که لوله­‌های موئین حاوی نمونه به صورت افقی روی آن قرار می­‌گیرند. بعد از انجام سانتریفیوژ با استفاده از یک صفحه درجه­‌بندی شده، مقدار هماتوکریت بدست می­‌آید.

میکروسانتریفیوژ

از این نوع سانتریفیوژ آزمایشگاهی برای نمونه‌­های با حجم کم غالباً کمتر از 1/5ml (مانند نمونه‌­های گرفته شده از اطفال) استفاده می‌­شود. میکرو سانتریفیوژ ها در مدل‌های با دور پایین و دور بالا ساخته می­‌شوند. در دور پایین حداکثر سرعت 13000 rpm بوده و برای خون و سایر محصولات خونی کاربرد دارد. در مدل‌­های با دور بالا حداکثر سرعت به 28000 rpm نیز رسیده و برای جمع‌­آوری سلول­‌ها و میکرو ارگانیسم ­ها و بررسی ارگانل‌­های سلولی کاربرد دارند. غالباً لوله‌­هایی که در میکروسانتریفیوژها استفاده می‌­شوند از جنس پلاستیک و یکبار مصرف بوده، دارای یک سطح مقطع مخروطی و دارای سرپوش می‌باشند.

سانتریفیوژ آزمایشگاهی شستشو دهنده سلول

از این نوع سانتریفیوژ جهت شستشو، دکانته کردن، مخلوط کردن و شستشوی مجدد یاخته­‌های قرمز خون قبل از آزمایشات متعددی چون Antiglobulin استفاده می­‌شود.

مقایسه سانتریفیوژ­ها

مقایسه سانتریفیوژ­ها بر­اساس RCF است که توانایی تفکیک یک سانتریفیوژ را به خوبی مشخص می‌­کند. اثر RCF بر روی یک نمونه به فاصله ثابت نمونه از مرکز چرخش بستگی دارد. به علت اینکه فاصله عمق نمونه با قسمت‌­های سطحی آن از مرکز متفاوت است. اثر RCF بر روی نواحی عمقی یک نمونه بیشتر از نواحی سطحی آن خواهد بود.

عمل سانتریفیوژ آزمایشگاهی از سه طریق اصلی اجرا می­‌شود که عبارتند از:

1. رسوب ­دهی تمایزی (Differential Pelleting): در روش رسوب‌­دهی تمایزی ابتدا ذرات تقریباً به طور یکنواخت در محلول معلق هستند. با شروع کار سانتریفیوژ، ذرات با سرعت­‌های متفاوت به سمت انتهای لوله یا در جهت نیروی سانتریفیوژ حرکت می‌کنند. روش رسوب‌­دهی تمایزی در اصل جداسازی در محیط یکنواخت می­‌باشد. 
2. سرعت منطقه‌­ای (Rate – Zonal): در روش سرعت منطقه‌­ای جداسازی به سرعت نسبی مناطق مختلف بستگی دارد.
3. ایزو پیکریک (Isopycric): در روش ایزوپیکریک اما به دانسیته ذرات شناور در محیط وابسته است. در روش­‌های فوق، ذرات مختلف بصورت نوارهایی در طول گرادیان محیط، در اثر سانتریفیوژ جدا می­‌شوند.

12 نکته مهم هنگام کار با سانتریفیوژ 

1. سانتریفیوژ آزمایشگاهی باید کاملاً صاف و افقی قرار گیرد تا دستگاه در صورت عدم تعادل در حین کار حرکت نکند. سانتریفیوژ باید روی سطح محکم و صاف قرار گیرد.
2. به مسئله بالانس (توازن) توجه کنید. اندازه، وزن، شکل و حجم محلول در لوله­‌های مقابل یکدیگر مشابه باشد. اگر تعداد لوله فرد است، از لوله حاوی آب استفاده کنید. بالانس، عمر دستگاه را زیاد می‌­کند و زغال دیرتر خراب می‌­شود.
3. سانتریفیوژ های میکرو و هماتوکریت نیازی به رعایت موازنه ندارند، چون وزن موتور خیلی بیشتر از وزن و محتویات لوله‌­های موئینه است و اثر وزن یک لوله موئینه بسیار ناچیز و قابل چشم­‌پوشی است.
4. پیچ تنظیم سرعت سانتریفیوژ باید به آرامی چرخانده و زیاد شود.
5. در صورت شنیدن صدای ناهنجار یا لرزش غیر ­عادی فوراً سانتریفیوژ آزمایشگاهی را خاموش کنید.
6. بعد از استفاده از دستگاه، جا لوله‌ ه­ای شسته و خشک شوند.
7. تمیز کردن روزانه سانتریفیوژ و ضد عفونی آن با گلوتار آلدئید 1% توصیه می­‌شود.
8. برس‌­ها، زغال و سایر قسمت­‌های دستگاه هر 3 ماه یک بار کنترل شده و در صورت لزوم عوض شوند.
9. قسمت­‌های زنگ‌­زده، خورده شده را تراشیده و با گازوئیل تمیز کرده و رنگ ­‌آمیزی کنید.
10. بعد از شکستن یا ریختن نمونه در سانتریفیوژ فوراً آن را خاموش کنید. پنجره­‌ها را باز کنید، 15 دقیقه اتاق را ترک کنید (تا آئروسل‌­های بزرگ ته­‌نشین و با هوا رقیق شوند) سپس با ماسک و دستکش با ماده ضد عفونی مناسب آنرا تمیز و ضدعفونی کنید. (گلوتار آلدئید 1%)
11. هیچگاه با درب باز سانتریفیوژ را روشن نکنید. تا دو دقیقه پس از توقف کامل سانتریفیوژ آزمایشگاهی، درب آنرا باز نکنید. سانتریفیوژهای دارای درب قفل­‌دار توصیه می­‌شوند.
12. از سرعت بیش از حد لزوم استفاده نکنید.