موارد استفاده
EDTA جهت آزمایشات زیر در هماتولوژی توصیه می گردد.
1 – هماتوکریت (روش میکروهماکریت) – شمارش پلاکت – شمارش گلبولهای سرخ و سفید اندازه گیری هموگلوبین – گسترش خون محیطی جهت افتراق سلولی – شمارش رتیکولوسیت – فلوسیتومتری – سدیمانتاسیون (پس از تصحیح باسیترات سدیم). نمونه خون تهیه شده با ضد انعقاد EDTA در مدت 6 ساعت در حرارت آزمایشگاه باید از آزمایش گردد. استفاده از EDTA در سایر موارد مثل اندازه گیری سیکلوسپورین (Cyclosporin) و عناصر بسیار کمیاب توصیه شده است. لازم به ذکر است که نمکهای EDTA می توانند با ظروف فلزی یا درب آنها واکنش نشان داده و یونهای فلزی را آزاد کنند بنابراین برای استفاده از EDTA باید از ظروف مناسبی استفاده شود.
انواع EDTA
EDTA به صورت اسید آزاد به تنهائی بعنوان ضد انعقاد مصرف نمی گردد. بیشتر نمکهای آن مورد استفاده قرار می گیرد. اسید آزاد آن دارای وزن ملکولی 2/292 و به صورت پودر سفید بدون بو می باشد. محلول اشباع آن (در 20 درجه سانتیگراد) 2000 تا 300 میلی گرم در لیتر است.
EDTA دی سدیک به همراه دو ملکول آب (EDTA-NA2, 2H2O) دارای وزن ملکولی 2/372 و به صورت پودر کریستال بدون بو می باشد. حلالیت آن در حرارت 20 درجه سانتیگراد است.
EDTA دی پتاسیک به همراه دو ملکول آب (EDTA-K2, 2H2O) دارای وزن ملکولی 4/404 می باشد. این نوع بیشتر در اروپاو ژاپن استفاده می شود و به تازگی در آمریکا مورد توجه قرار گرفته است. این نمک نسبت به نمکهای دی سدیک از حلالیت بیشتری برخوردار است.
EDTA تری پتاسیک (EDTA-K3) دارای وزن ملکولی 406 و بصورت مایعی شفاف، بدون بو می باشد، نوع خشک شده آن به صورت پودر سفید بدون بو است.
PH نمکها
PH نمکهای تری پتاسیک نزدیک به PH خون (8-7) می باشد، این مقدار بالاتر از PH نمکهای دی سدیک (3/5–5/4) است، در تستهای خاصی که بستگی به شرایط اسیدی یا قلیائی دارند می توان با توجه به PH مورد لزوم EDTA مناسب را بکار برد. در PH کمتر از چهار، کمپلکس متصل به کلسیم پایدار نبوده و ممکن است تجزیه و جدا گردد.
خواص ضد انعقاد
بطور کلی EDTA بعنوان یک ماده ضد انعقاد در تستهای انعقادی بکار نمی رود مگر هنگامیکه بررسی و آزمایش پلاکت مورد نظر باشد. باید توجه نمود که در بعضی بیماران بعلت وجود آنتی بادیهای پلاکتی، با وجود EDTA پلاکتها به صورت چسبیده به یکدیگر مشاهده می شوند، لذا در این موارد نباید EDTA مصرف گردد. در ضمن قابل ذکر است که فاکتور V در مقابل EDTA ناپایدار است.
مقادیر لازم
میزان مصرف EDTA-K3 ، 2/1 میلی گرم برای هر میلی لیتر خون است ولی EDTA دی پتاسیک و دی سدیک همراه با دو ملکول آب 25/0 ± 5/1 میلی گرم برای هر میلی لیتر خون مورد استفاده قرار می گیرد.
پایداری نمونه
در حرارت آزمایشگاه بیشتر از 6 ساعت از زمان گرفتن خون در لوله حاوی EDTA نباید بگذرد ولی در حرارت 4 درجه سانتیگراد (یخچال) تا 24 ساعت P.C.V, Hb, W.B.C, R.B.C, MCV, Platelet پایدار است.
مقدار EDTA مصرفی باید متناسب با مقدار خون باشد و اگر EDTA بیشتر از اندازه مصرف گردد گلبولهای سرخ و سفید چروکیده و منهدم می گردند که این به علت افزایش غلظت یونی می باشد. افزایش EDTA بیش از 2 میلی گرم در میلی لیتر سبب کاهش قابل توجهی در P.C.V و در نتیجه افزایش MCHC می شود و نیز همین افزایش بر روی پلاکتها اثر گذاشته و سبب تورم و پاشیدگی آنها می شود، شمارش مجدد این ذرات پلاکنی سبب افزایش غیرواقعی تعداد پلاکتها می گردد. کاهش میزان EDTA باعث ایجاد لخته های ریز گردیده که تاثیر قابل توجهی در اندازه گیری پلاکتها می گذارند.
تاثیر ماده ضد انعقاد روی انگل مالاریا
برای تشخیص انگل مالاریا استفاده از گسترش بدون ماده ضد انعقاد است که بطور مستقیم از خون مویرگی و یا وریدی تهیه شده باشد. ولی چون برخی از نمونه ها از سایر مراکز ارسال می گردد و یا انگل بطور اتفاقی همراه با ماده ضد انعقاد دریافت می شود لازم است که از اثرات ماده ضد انعقاد بر روی مالاریا اطلاع داشت.
کلیه مواد ضد انعقاد سبب تغییراتی در انگلهای مالاریا گردیده که با توجه به چرخه زندگی انگل، فاصله طی شده تا انجام آزمایش و نوع ماده ضد انعقاد مورد مصرف متفاوت می باشد.
چنانچه استفاده از ماده ضد انعقاد الزامی است بهتر است هر چه سریعتر گسترش را تهیه نمود.
ماده ضد انعقاد انتخابی EDTA دی پتاسیک است، این ماده برای مدت کوتاهی تغییراتی در روی انگل بوجود نمی آورد ولی اگر بیش از 6 ساعت در مجاورت خون باشد سبب اختلالات زیر می گردد.
1 – مرحله تکامل جنسی سیر خود را ادامه خواهد داد و میکروگامتوسیت پس از بلوغ گامتوسیت را داخل خون آزاد می کند. این گامتها در تشخیص افتراقی با بورلیا قرار می گیرند.
گامتوسیتهای هلالی شکل پلاسمودیوم فالسیپارم بدور خود جمع شده شبیه پلاسمودیوم مالاریا می شوند.
2 – تروفوئیت بالغ پلاسمودیوم ویواکس در اثر تماس طولانی با EDTA بهم فشرده شده و اگر این زمان بیش از اندازه طولانی باشد گلبولهای سرخ حاوی گامتوسیت و شیزونت بالغ همراه انگل نابود میشوند ولی رنگدانه هموزین مالاریا همیشه پایدار است و می تواند برای یک فرد با تجربه کمکی در جهت یافتن و حتی تشخیص نوع انگل باشد.
3 – نمای گلبول سرخ با دندانه دار شدن و رویهم قرار گرفتن دیواره سلولی تغییر می کنند.
4 – گلبولهای سرخ منقوط (مبتلا به پلاسمودیوم ویواکس) قابل رویت نخواهد بود.
هر گاه نمونه برداری در اتر EDTA تغییرات قابل توجهی نشان دهد بهتر است نمونه گیری را تکرار نموده و در این صورت گسترش را به صورت مستقیم و بدون استفاده از ماده ضد انعقاد تهیه نمود.
تشخیص EDTA
روشهای متفاوتی جهت تشخیص انواع EDTA وجود دارد که ساده ترین آن عبارتست از :
دو قطره از محلول تیوسیانات آلومینیوم (8 گرم درصد میلی لیتر آب مقطر) و دو قطره از محلول کلرور فریک (9 گرم درصد میلی لیتر آب مقطر) را به 5 میلی لیتر آب مقطر بدون یون در لوله آزمایش اضافه می کنیم محلول قرمز رنگی حاصل می شود. تقریباً در حدود 50 میلی گرم نمک مورد نظر را به محلول فوق اضافه کرده در صورت وجود EDTA ، رنگ قرمز تبدیل به زرد خواهد شد.
امروزه لوله های آزمایشگاهی شیشه ای به دلیل چندبار مصرف بودن، قابلیت شکستن و قدرت القاء لخته به خون، کمتر مورد استفاده قرار گرفته و به جای آن لوله های پلاستیکی یا سیلیکون تجاری به بازار آمده اند که حتی در دورهای بالای سانتریفیوژ هم شکسته نشده و به دلیل داشتن درب پلاستیکی از خطر آلوده کنندگیِ به مراتب کمتری برخوردار هستند.
برخی لوله های پلاستیکی فاقد ضدانعقاد بوده و برای گرفتن نمونه لخته مورد استفاده قرار می گیرند ولی چون شیشه ای نیستند، مدت زمان زیادی را برای لخته شدن کامل و جدا شدن سرم شفاف و بدون فیبرین نیاز دارند. این لوله ها اغلب درب قرمز دارند که گاهی در ته خود حاوی ساچمه های پلاستیکی آغشته به مواد ترومبوژن (محرک انعقاد) بوده و باعث لخته شدن سریع خون می شوند. از مواد ترومبوژن می توان به ترومبین (یا فاکتور )II اشاره نمود.
لوله هایی که فقط حاوی فعال کننده ترومبین هستند، درب نارنجی داشته و برای انجام اورژانسی تست های بیوشیمی مورد استفاده قرار می گیرند. این لوله ها هرگز برای بررسی های هماتولوژی کاربردی نداشته و فقط برای سنجش مقادیر بیوشیمی (آهن، TIBC ، فولات، B12 ، بیلی روبین و …) سرولوژی، ایمونولوژی و دیگر پارامترها به کار گرفته می شوند.
RBC ها به دلیل چگالی بیشتری که نسبت به دیگر سلولها و عوامل مختلف خون دارند، سانتریفیوژ در ته لوله جمع شده و پلاسما یا سرم در روی آن قرار می گیرد. گاهی برای جداسازی بهتر و راحت تر سرم، به تهِ لوله های آزمایش ژل مخصوصی اضافه می شود که چگالی کمتر از RBC ها و بیشتر از سرم دارد، لذا بعد از نمونه گیری و سانتریفیوژ خون، RBC ها در زیر ژل و سرم در روی ژل قرار می گیرد. این نوع لوله ها درب طلایی رنگ داشته و به لوله های SST یا لوله های جداکننده سرم نیز معروف هستند. این لوله ها دارای مزایای زیادی نسبت به لوله های ساده می باشند. این نوع لوله ها به جهت کاهش زمان آماده سازی نمونه ی خون برای انجام آزمایش های بالینی و جداسازی کامل و مؤثر سرم خون از سلول های خونی به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی مورد استفاده قرار می گیرد. لوله هایی با درب زرد و سیاه نیز وجود دارند که حاوی مواد نگهدارنده و مغذی جهت زنده نگه داشتن میکروارگانیسم ها هستند.
به منظور ارزیابی های مورفولوژیک سلول های خونی و نیز شمارش آنها، می بایست نخست از لخته شدن نمونه خون جلوگیری نمود که ضدانعقادها چنانچه از نامشان پیداست، برای همین منظور بکار گرفته می شوند.